Ginecologia ed ostetricia


PROGETTO
Progenitori epatici da cordone: definizione dei profili genetici e pattern differenziativi per un approccio di terapia cellulare.

Dott. Rodolfo Marchese

Le cellule staminali sono cellule dotate di un elevato potenziale riproduttivo e possono differenziarsi in cellule appartenenti a tessuti diversi. Le cellule staminali embrionali (ES) sono state le prime ad essere isolate nei topi negli anni ottanta; tuttavia, studi recenti hanno individuato la presenza di cellule staminali anche nell’individuo adulto. In particolare, le ES presentano una maggior plasticità e più elevata capacità autoriproduttiva di quelle adulte (ASC).
Attualmente, cellule staminali adulte di origine midollare (BMSC) sono impiegate di routine nel trapianto del midollo osseo e cellule staminali di origine cutanea, nei trapianti in pazienti ustionati.
E’ ormai certo che la potenzialità delle cellule staminali, embrionali e adulte, è molto maggiore di quanto inizialmente ipotizzato. Le cellule staminali embrionali di topo sono state indotte a differenziarsi in cellule pancreatiche endocrine del tutto funzionali e capaci di migliorare la glicemia in topi trapiantati. E’ stato inoltre evidenziato che cellule staminali adulte esistono anche in tessuti diversi da sangue e cute e sono dotate di plasticità superiore ad ogni aspettativa. Cellule staminali del muscolo o del sangue possono, infatti, svilupparsi l’una nel tessuto dell’altro e quelle del cervello possono differenziarsi non solo in cellule neurali, muscolari e ematiche ma anche in cellule di altri tessuti, quali intestinale, epatico e cardiaco.
Cellule staminali adulte del sangue circolante possono differenziarsi in cellule nervose, mentre quelle del midollo osseo possono svilupparsi in cellule miocardiche funzionanti in grado di riparare infarti del miocardio.
Le recenti scoperte che cellule staminali ematopoietiche possono migrare nel fegato e differenziarsi in epatociti, sia nei modelli dei roditori che nell’uomo, ha posto il quesito se tali cellule possano essere indotte alla rigenerazione e giocare un ruolo nella ripopolazione degli epatociti.
Questa potenzialità inaspettata delle cellule staminali dell’adulto ha suscitato molti entusiasmi ed aspettative terapeutiche e ha posto anche il problema se il trapianto di cellule staminali, in determinate e controllate condizioni, possa diventare una realtà terapeutica nel trattamento di patologie croniche del fegato, sia di origine ereditaria che acquisita.
Le cellule staminali del fegato, o di altri tessuti, potrebbero rappresentare una sorgente alternativa di epatociti umani nei trapianti di fegato. Per la potenziale rigenerazione delle cellule epatiche, molto interessanti sembrano essere anche le c.d. cellule ovali, una popolazione cellulare che emerge in presenza di necrosi epatica estesa, la cui origine è tuttora sconosciuta, ma di cui è nota la pluripotenzialità differenziativa, sia verso la linea epatocitaria, sia verso l’epitelio dei dotti biliari. Esse esprimono marcatori specifici delle cellule ematopoietiche tra cui il Th1.1, CD34, Flt3-receptor e c-Kit; esprimono anche a FP, CK19, ?-GT e OV-6. Esse inoltre potrebbero rappresentare il compartimento staminale epatico.
Molto recentemente si è riusciti ad ottenere in vitro, da cellule staminali umane, sia di origine midollare che cordale, cellule parenchimali mature che esprimono i marcatori differenziativi e di funzionalità epatica, come già era stato dimostrato in vivo in esperimenti di “engraftment” in modelli murini, e anche nell’uomo in soggetti allotrapiantati.
Restano tuttavia ancora da definire molti dei meccanismi che regolano questi processi.

Scopo ed importanza della ricerca

Recentemente è stato da noi messo a punto un procedimento che ci ha consentito di ottenere in vitro cellule epatiche funzionali, a partire da cellule progenitrici presenti nel sangue di cordone ombelicale.
La ricerca sulle cellule staminali progenitrici epatiche da noi proposta è focalizzata alla caratterizzazione biologico-molecolare del modello da noi messo a punto. In particolare, si vuole ora sviluppare lo studio e l’individuazione dei diversi fattori regolatori e microambientali che determinano gli orientamenti differenziativi delle cellule progenitrici, come avviene nel fegato embrionale nel normale processo di sviluppo differenziativo, o nel fegato adulto rigenerante. Ciò allo scopo di poter dirigere, “secondo necessità”, il pathway differentiativo di cellule progenitrici purificate per ottenere pool cellulari omogenei e con elevato potenziale rigenerativo per le diverse componenti cellulari epatiche, principalmente epatociti e colangiociti, utilizzabili in trials clinici di trapianto cellulare. Le cellule staminali progenitrici da noi utilizzate per la messa a punto del modello di differenziamento epatico, in seguito a stimolazione con fattori epatospecifici sviluppano un quadro di espressione dei marcatori di superficie pressoché identico a quello delle cellule di fegato fetale. In particolare, esse mantengono per tempi prolungati l’espressione del gene c-kit (che lega lo stem cell factor, SCF). L’espressione di questo gene è rappresentativa del compartimento di cellule staminali “intra organo” normalmente presente nei canalicoli biliari, c.d. canali di Hering, che una crescente massa di dati indica come il “recervoir” fisiologico da cui origina la mobilizzazione e la rigenerazione degli epatociti nei casi di grave danno epatico (necrosi massiva del fegato, cirrosi etc). A livello dei canali di Hering e dei canalicoli biliari avviene anche il reclutamento dalla circolazione di cellule staminali mobilizzate da altri compartimenti (ad esempio midollo osseo), da immettere nel sistema rigenerativo epatico. I meccanismi coinvolti in questo “engraftment” dalla circolazione non sono stati ancora chiariti. Studi su altri organi suggeriscono un coinvolgimento di g-CSF (growth cell stimulating factor) nella mobilizzazione da midollo. Per quanto riguarda il reclutamento e la mobilizzazione verso il fegato di cellule staminali circolanti, la loro integrazione coordinata e il differenziamento in cellule parenchimali epatiche con piena funzionalità, tutto resta ancora da chiarire. Ai fini dello sviluppo di terapie di trapianto cellulare, è pertanto di estrema importanza individuare i fattori responsabili del reclutamento, della mobilizzazione, dell’ “engraftment” epatico e degli indirizzi differenziativi delle cellule staminali progenitrici epatiche. Tale indagine è stata finora limitata proprio dalla mancanza di un idoneo sistema di riferimento in vitro e dalla difficoltà del reperimento e della coltura degli epatociti espiantati. Un sistema modello di epatociti fetali che mantiene, in vitro, lo stato differentiante per alcuni mesi è stato messo a punto nel laboratorio del Prof. Peschle. Nella differenziazione epatocitaria del topo esiste ad esempio una finestra nello sviluppo epatico, in cui le cellule epiteliali del fegato sembrano avere la capacità di cambiare il pattern d’espressione genica fenotipica da epatocitica a dutturale e viceversa, a seconda delle condizioni microambientali o di coltura. Il lavoro del prof. Peschle ha evidenziato come il modello colturale ricapitoli il processo di sviluppo del fegato fetale: i) una iniziale compresenza di cellule di tipo mesenchimale e parenchimale; ii) eliminazione delle cellule ematopoietiche; iii) committment epatocitario e inizio della funzionalità.

Approccio sperimentale

Noi vogliamo analizzare il microambiente cellulare delle colture di cellule staminali progenitrici CD133+, purificate da cordone ombelicale per indagare i timing differenziativi e se esista nell’uomo una finestra di sviluppo epatico anche nel commitment indotto in vitro.
In una prima parte del lavoro abbiamo identificato le condizioni colturali ottimali per indurre commitments differenziativi mirati condizionando il terreno di coltura con diversi cocktails di fattori regolatori epato-specifici (FGF4, HGF), sali rari; utilizzando sistemi serum free e/o sieri autologhi; utilizzando substrati cellulari diversi (presenza o meno nel medium di matrici organiche o di feeder layers) e variando i tempi dei passaggi in vitro.
In questa seconda parte del nostro studio, ci proponiamo di monitorare la modulazione dei profili di espressione genica e dei pattern differenziativi durante il differenziamento in vitro dei precursori epatici.
Inseguito, ci proponiamo di verificare le potenzialità di tale sistema per un approccio terapeutico cellulare.
Modelli murini verranno utilizzati per verificare la capacità di “engraftment” dei precursori nei fegati di topi immunodeficienti o epatolesi:
• Iniettando pool di cellule progenitrici senza espansione e/o dopo espansione;
• Iniettando pool di cellule progenitrici dopo trattamento con fattori differenziativi diversi a diversi tempi;
• In entrambi i casi, gli esperimenti verranno effettuati in presenza ed in assenza di fattori mobilizzanti (g-CSF).

ASPETTI DI ORIGINALITA’ RISPETTO ALLA LETTERATURA CORRENTE

Disporre di un sistema cellulare in coltura che consente l’espansione in vitro del pool staminale e il “commitment” verso la linea epatocitaria delle cellule progenitrici, permette di avere una sorgente continua di epatociti di origine cordale umana per lo studio del pattern di espressione genica e fenotipica e l’individuazione dei profili genetici preferenziali. Ciò rende possibile l’individuazione della finestra differenziativa epatica anche nell’uomo; è fondamentale per la comprensione del processo differenziativo stesso e può consentire lo viluppo di terapie cellulari di trapianto mirate per patologie epatiche attualmente non curabili.

TRASFERIBILITA’ DEI RISULTATI E DEI PRODOTTI

• Sviluppo di una terapia genica e cellulare per la rigenerazione epatica basata sull’utilizzo di cellule staminali progenitrici a diversi stadi differenziativi.;
• Sviluppo di organi bioartificiali.

MATERIALI E METODI

Approccio metodologico

Modelli in vitro
Verranno utilizzate cellule progenitrici epatiche derivate da cordoni ombelicali secondo le condizioni già descritte nel Brevetto Crema et al.
In sintesi: la popolazione cellulare CD133+ verrà isolata e purificata da cordone mediante biglie immunomagnetiche (Miltenji); espansa in vitro per 10-14 giorni e successivamente indotta a differenziare verso la linea epatica.
Immunofenotipizzazione. L’espressione differenziale dei marker di superficie e di funzionalità verrà seguita prima, durante e dopo induzione al commitment epatocitario mediante FACS e immunofluorescenza
Estrazione e purificazione dell’RNA cellulare e dei microRNAs. L’RNA e i microRNAs saranno estratti dalle cellule progenitrici epatiche in differenziamento utilizzando i kit Ambion Cell-to-DNA e mirVana, la cui metodica si basa sulla estrazione organica con sali caotropici associata a fenolo acido/cloroformio seguita da purificazione preferenziale attraverso filtri a fibra di vetro, che permette di ottenere preparazioni estremamente pure di mirRNA da culture cellulari o tessuti bioptici.
RT-PCR, Q-PCR
Permetteranno la valutazione dell’espressione cellulare degli RNAs e dei microRNAs epatospecifici e dei markers differenziativi e di funzionalità nelle cellule in differenziamento.
MicroArray
Mediante tale tecnica verrà analizzata la variazione dei profili di espressione genica cellulare prima, durante e dopo la differenziazione epatocitaria indotta. Come controlli saranno utilizzate linee di epatoma, cellule di fegato fetale, cellule di fegato adulto e cellule mesenchimali.
Western blot. L’analisi mediante immunoblotting utilizzando mAbs (monoclonal anti-bodies) specifici, permetterà di valutare l’espressione e la produzione delle proteine (Albumina; AFP) e dei fattori epatospecifici (HGF; HNF4) nelle cellule epatiche in differenziamento.
Modelli murini Verranno utilizzati topi immunodeficienti e/o epatolesi per verificare la capacità di “engraftment” dei precursori nei loro fegati

Progetto in collaborazione con:

• ISTITUTO DI NEUROBIOLOGIA E MEDICINA MOLECOLARE del CNR afferente al Dipartimento di Medicina del CNR diretto dal Prof G.Condorelli - Dr.sa A.Crema e Dr. G. Carloni

• ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ Dip. Biologia Cellulare e Neuroscienze - Dr. Massimo Sanchez

• INSERM UMR542 di PARIGI “Greffes d’ephitheliums et Regulation dell’activation lymphocytaire” diretto dal Prof. Bernard Cherpentier H. O. Paul Brousse - Prof. B. Azzarone ed il Prof. A. Durrbach

Collaborazioni con l’attività clinica

Indagini molecolari

• Studio delle alterazioni nel gene Tp53 mediante sequenziamento

• Caratterizzazione genotipica del virus del papilloma umano (HPV)

• Analisi genetica per l’identificazione dei genotipi resistenti a farmaci in pazienti sottoposti a terapia anticoagulante orale

• Analisi molecolare delle mutazioni nel gene KRAS per l’identificazione di pazienti resistenti alla terapia con i farmaci oncologici molecolari