Ginecologia ed ostetricia


PROGETTO
Terapie antineoplastiche innovative nei tumori solidi dell’infanzia

Dott.ssa Barbara Bucci

Razionale. Ai tumori solidi dell’infanzia di derivazione neuro-ectodermica appartengono i tumori primitivi cerebrali e i tumori extra-cranici. L'Astrocitoma è il più diffuso tumore cerebrale, il cui confine con il tessuto cerebrale sano circostante è molto sfumato, non vi è un limite netto e si trovano cellule tumorali anche a distanza dalla lesione più evidente.
Per le caratteristiche istologiche e per le conseguenti implicazioni terapeutiche si distinguono quattro gradi di malignità: grado I e II a bassa malignità, grado III e IV a maggiore malignità. Gli Astrocitomi di grado I e II hanno maggior incidenza in età pediatrica e fra i giovani adulti, rispondono poco alle terapie farmacologiche e alla radioterapia e la rimozione chirurgica è possibile solo nei casi di pazienti con tumore di piccole dimensioni in un’area non eloquente (ovvero una zona cerebrale la cui lesione non porti menomazioni alla persona, come ad esempio paralisi, impossibilità nel parlare).
Lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e di nuovi farmaci più attivi e meno tossici è dunque essenziale. La possibilità di sviluppare strategie antitumorali alternative alle convenzionali utilizzando le informazioni ottenute dagli studi cellulari e molecolari, può permettere lo sviluppo di terapie innovative antineoplastiche molecolari in grado di colpire bersagli cellulari, la cui modulazione, potrebbe ripristinare le normali funzioni della cellula.


OBIETTIVI

Progettazione disegno sperimentale e pianificazione esperimenti
Studi recenti hanno identificato la presenza di anomalie genetiche tra cui iper-espressione dell'oncogene del proto-oncogene myc nell’astrocitoma. La deregolazione di c-myc gioca un ruolo chiave nella progressione e nella risposta al trattamento.
1) Effetto dell’inibizione e dell’iperespressione della proteina c-Myc, utilizzando diverse linee cellulari umane di astrocitoma T98G, ADF, U87 e U373MG, sulla crescita, il ciclo cellulare e sull’induzione del processo apoptotico.
2) Definizione dell’eventuale “cross-talk” e cooperazione fra e c-Myc e geni che codificano per le cicline e chinasi ciclina-dipendenti e come attivatori dei segnali di morte.

Metodologie:

Valutazione dei parametri di crescita e vitalità cellulare. Curva di crescita: conta giornaliera delle cellule vitali (colorazione con Trypan blue) in presenza dei diversi trattamenti. Test MTT, che ci permetterà di determinare quantitativamente la citotossicità dei trattamenti applicati. Capacità clonogenica.
Studio del ciclo cellulare Analisi delle perturbazioni del ciclo cellulare. L’analisi del ciclo cellulare verrà effettuata in citometria a flusso mediante colorazione con ioduro di propidio e/o incorporazione con bromodeossiuridina, metodica che permette di analizzare accuratamente il compartimento di sintesi del ciclo cellulare.
Studio dell’espressione genica. L’analisi dell’espressione dei geni pertinenti verrà effettuata valutando sia i livelli dell’RNA messaggero che della proteina codificata.
Per la determinazione quantitativa delle proteine: Western blotting. Coimmunoprecipitazione. Citometria a flusso: verranno utilizzate metodiche di immunofluorescenza diretta ed indiretta con anticorpi monoclonali e/o policlonali, con la possibilità di effettuare analisi biparametriche valutando l’espressione di proteine in relazione al ciclo. Per la determinazione quantitativa dell’mRNA: Northern blotting di RNA totale o di RNA polyA+. Trascrizione inversa accoppiata ad analisi con PCR (RT-PCR quantitativa).