Ginecologia ed ostetricia


PROGETTO
Relazione tra infezione da HPV, fertilità e gravidanza: meccanismi molecolari coinvolti nell’abrogazione dei checkpoints del ciclo cellulare

Dott.ssa Barbara Bucci

Razionale. I Papillomavirus umani (HPV) comprendono virus a DNA responsabili di lesioni dell’apparato genitale. Studi hanno dimostrato come un’infezione persistente da HPV ad alto rischio aumenti la frequenza di sviluppare una neoplasia cervicale intraepiteliale di grado elevato. Esistono, inoltre, dati che dimostrano la correlazione tra la risoluzione dell’infezione da HPV e la regressione delle lesioni cervicali. L’alterata regolazione del ciclo cellulare, responsabile della trasformazione maligna, è determinata dalla specifica affinità dell’ HPV per l’epitelio squamoso e le sue cellule progenitrici. In particolare, i genotipi HPV (16,18) sono in grado di promuovere le lesioni grazie a proteine virali (E6, E7) che esercitano la loro azione oncogenetica interferendo con oncosoppressori fondamentali nella regolazione del ciclo cellulare. (pRb, p53). Il potenziale oncogeno delle proteine E6 ed E7 è dovuto alla capacità di queste proteine virali di legare ed inibire i prodotti di pRb e p53 rispettivamente. Tuttavia è convinzione crescente che le oncoproteine E6 ed E7 esercitano la loro azione trasformante interagendo con numerosi altri bersagli cellulari coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare. Quindi il nostro studio è volto a meglio comprendere i meccanismi molecolari che sono alla base dell'attività regolatrice di questi geni ciclo-relati (ciclina D1, ciclina A, ciclina E, inibitori chinasi-ciclina-dipendenti, p16, p27, p21, p57).

OBIETTIVI

Progettazione disegno sperimentale e pianificazione esperimenti
1) Maggiore comprensione dei meccanismi di controllo della proliferazione cellulare in linee cellulari umane HPV positive
2) Ruolo delle molecole ciclo-relate (ciclina D, ciclina A, ciclina E, inibitori chinasi-ciclina-dipendenti, p16, p27, p21, p15, p16, p53) quali possibili biomarkers cellulari ai fini di una più precoce diagnosi, un adeguato follow-up e per una più idonea scelta dei trattamenti terapeutici della patologia preneoplastica e neoplastica della mucosa genitale in donne in età fertile e in gravidanza.
3) Selezionare, arruolare e seguire il follow-up di una coorte di pazienti (donne in età fertile e in gravidanza) con infezione genitale da HPV, diagnosticare e tipizzare l'infezione da HPV, valutare l'associazione tra il riscontro di lesioni precancerose e sterilità, capacità di iniziare una gravidanza, ed aumentata frequenza di aborti spontanei.

Metodologie:

Studio del ciclo cellulare Analisi delle perturbazioni del ciclo cellulare. L’analisi del ciclo cellulare verrà effettuata in citometria a flusso mediante colorazione con ioduro di propidio e/o incorporazione con bromodeossiuridina, metodica che permette di analizzare accuratamente il compartimento di sintesi del ciclo cellulare.

Studio dell’espressione genica. L’analisi dell’espressione dei geni pertinenti verrà effettuata valutando sia i livelli dell’RNA messaggero che della proteina codificata.
Per la determinazione quantitativa delle proteine: Western blotting. Coimmunoprecipitazione. Citometria a flusso: verranno utilizzate metodiche di immunofluorescenza diretta ed indiretta con anticorpi monoclonali e/o policlonali, con la possibilità di effettuare analisi biparametriche valutando l’espressione di proteine in relazione al ciclo.
Per la determinazione quantitativa dell’mRNA: Northern blotting di RNA totale o di RNA polyA+. Trascrizione inversa accoppiata ad analisi con PCR (RT-PCR quantitativa).